摘要：青蟹呼腸孤病毒(mudcrabreovirus,MCRV)是養(yǎng)殖擬穴青蟹(Scyllaparamamosain)致死率最高的病原之一，青蟹種蟹及其幼體攜帶該病原對青蟹養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展造成了重大威脅。為從源頭切斷該病原的感染和傳播，本研究研發(fā)了一種篩選無MCRV種蟹的熒光定量檢測方法。為最大限度地提高檢測靈敏性，首先，本研究分析MCRV在感染青蟹主要組織中的含量，發(fā)現(xiàn)血淋巴中病毒載量最高；隨后，分析該病毒的13個預(yù)測基因在血淋巴中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)病毒VP11基因相對表達(dá)量最高；最后，基于VP11基因序列保守區(qū)設(shè)計特異引物，建立了一種SYBRGreen quantitativereverse-transcriptionPCR(qRT-PCR)檢測方法，該方法可精確檢測的病毒下限為50 copies/反應(yīng)。該檢測方法具有組織和靶標(biāo)基因選擇優(yōu)勢，靈敏性顯著高于早期報道的其他檢測方法。使用該方法對含有5種常見甲殼動物病原的樣品進(jìn)行檢測，均無特異性擴(kuò)增。抽取微量血淋巴(大約50μL/只)提取RNA，隨后使用該檢測方法對22只種蟹和20只市售青蟹進(jìn)行MCRV檢測，陽性率分別54.44%和85.00%。此外，利用該方法進(jìn)一步分析了MCRV在較低溫度下(21℃)在青蟹體內(nèi)的增殖情況，發(fā)現(xiàn)病毒感染早期MCRV呈指數(shù)方式增殖，隨后進(jìn)入平臺期，實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)無青蟹死亡?？傊?，本研究建立了一種靈敏性高、實(shí)用性強(qiáng)的MCRV檢測方法，既可用于微創(chuàng)條件下無MCRV種蟹篩選，也能滿足病原感染相關(guān)研究的需要。
