摘要：采用電子顯微鏡觀察和細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù),從湖北黃陂某養(yǎng)殖場(chǎng)患病大口黑鱸(Micropterus salmoides)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并分離到一株蛙病毒。患病大口黑鱸的臨床癥狀主要表現(xiàn)為體表出血、潰瘍,肝臟發(fā)白。將病魚(yú)內(nèi)臟組織勻漿超微濾液接種鱖腦細(xì)胞系(mandarin fish brain,MFB)細(xì)胞能產(chǎn)生典型細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect,CPE),病毒滴度達(dá)到108.36±0.15 TCID50/m L。細(xì)胞培養(yǎng)病毒的超薄切片電鏡觀察結(jié)果顯示,細(xì)胞質(zhì)中存在大量直徑約為150 nm左右的正六邊形病毒粒子,呈晶格排列。細(xì)胞培養(yǎng)病毒的人工感染大口黑鱸試驗(yàn)結(jié)果顯示,7 d內(nèi)試驗(yàn)魚(yú)死亡率高達(dá)100%,其臨床癥狀與自然發(fā)病魚(yú)相似。采用大口黑鱸病毒(largemouth bass virus,LMBV)的特異性PCR檢測(cè)方法對(duì)患病鱸組織樣品和細(xì)胞培養(yǎng)病毒樣品進(jìn)行檢測(cè),均能擴(kuò)增出241 bp的單一目的條帶。進(jìn)一步根據(jù)Gen Bank中LMBV主衣殼蛋白(major capsid protein,MCP)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,均能從上述樣品中擴(kuò)增出1392 bp的MCP基因開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF)全長(zhǎng)。將MCP氨基酸全序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示其與Santee-Cooper蛙病毒、孔雀魚(yú)病毒6型及大口黑鱸潰瘍綜合征病毒的MCP氨基酸序列同源性高達(dá)100%。系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果顯示,與感染魚(yú)類的虹彩病毒科蛙病毒屬病毒,如鱖魚(yú)蛙病毒、Santee-Cooper蛙病毒、孔雀魚(yú)病毒6型和大口黑鱸潰瘍綜合征病毒等聚成一支。這些結(jié)果證明,該分離株為虹彩病毒科蛙病毒屬的成員,暫命名為大口黑鱸蛙病毒(largemouth bass ranavirus,LMBRa V)湖北株LMBRa V-HB001。病毒敏感細(xì)胞系篩選試驗(yàn)結(jié)果表明,病毒LMBRa V-HB001感染鯉上皮瘤細(xì)胞(epithelioma papulosum cyprinid,EPC)、草魚(yú)性腺細(xì)胞(grass carp ovary,GCO)、大鯢肌肉細(xì)胞(giant salamander muscle,GSM)和鯽腦組織細(xì)胞(gibel carp brain,Gi CB)均能產(chǎn)生典型CPE,病毒滴度可達(dá)108.0 TCID50/m L以上。本研究首次在湖北省養(yǎng)殖大口黑鱸體內(nèi)分離與鑒定了LMBRa V病毒,建立了病毒的細(xì)胞培養(yǎng)方法,為進(jìn)一步研究該病毒的傳播、診斷和防控技術(shù)提供了重要參考。
